Практикум по гетерологичной экспрессии белков, Журавлева Д.Э., Исхакова З.И., Тризна Е.Ю., 2022

Практикум по гетерологичной экспрессии белков, Журавлева Д.Э., Исхакова З.И., Тризна Е.Ю., 2022.

   В учебно-методическом пособии содержится характеристика наиболее часто используемых бактериальных экспрессионных систем (плазмиды и штаммы), описания и протоколы стандартных методов получения рекомбинантных штаммов-продуцентов, индукции синтеза белка, оценка гиперпродукции методом электрофоретического разделения белка. Приводятся наиболее распространенные и общепринятые методики, не требующие дорогостоящих или редких реактивов и материалов, либо коммерческих наборов реагентов. Каждый метод содержит теоретическое описание и краткую характеристику, назначение метода, наиболее важные аспекты его практического использования, целевое назначение необходимых реактивов и оборудования, подробное последовательное описание стадий лабораторных операций.

Практикум по гетерологичной экспрессии белков, Журавлева Д.Э., Исхакова З.И., Тризна Е.Ю., 2022


Экспрессионные плазмиды.
Экспрессионная плазмида включает в себя следующие структурные элементы: точка Origin, экспрессионная кассета (промотор, сайт связывания рибосом, полилинкер - сайт с множеством уникальных сайтов для эндонуклеаз рестрикции, терминатор), селективный маркер (Рисунок 1).

Точка Origin. Ori или сайт начала репликации является необходимым структурным элементом любого плазмидного вектора. Это АТ-богатая последовательность ДНК. обеспечивающая автономную инициацию репликации плазмиды в клетках определенного вида микроорганизма с участием белков репликации самого микроорганизма. Сама плазмида не кодирует эти белки. Поэтому, точка Ori. распознаваемая белками Е. coli9 не будет активна в клетках других бактерий. Точка Ori со всеми ее регуляторными элементами называется репликоном.

Экспрессионная кассета включает в себя сильный промотор под контролем оператора, сайт связывания с рибосомой (RBS - ribosome binding site), полилинкер (участок с множеством уникальных сайтов для эндонуклеаз рестрикции для клонирования гена белка), терминатор, дополнительные последовательности. В качестве промоторов используются, как правило, промоторы фагов, которые обеспечивают высокий уровень транскрипции гена. В большинстве случаев также после промотора находится оператор, позволяющий «включать» транскрипцию гена только в определенное время.

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ.
ГЛАВА 1. ЭКСПРЕССИОННЫЕ СИСТЕМЫ.
1.1 Экспрессионные плазмиды.
1.2 Плазмиды для получения белков с аффинными олигопептидами (аффинными тагами)
1.3 Лактозный, тетрациклиновый и арабинозный операторы.
1.4 Штаммы E. coli для экспрессии рекомбинантных белков.
ГЛАВА 2. ЭКСПРЕССИЯ И ОЧИСТКА БЕЛКА.
2.1 Трансформация плазмидной ДНК клеток E. coli методом теплового шока (химическая трансформация).
2.2 Трансформация плазмидной ДНК клеток E. coli методом электропорации.
2.3 Скрининг рекомбинантных штаммов, обладающих максимальной гиперпродукцией белков.
2.4 Гиперпродукция белков в клетках E. coli и получение клеточных экстрактов.
2.5 Очистка белков на Ni-NTA сефарозе.
2.6 Очистка белков на Strep-tactin сефарозе.
2.7 Определение концентрации белка по методу Мэрион Брэдфорд.
2.8 Электрофорез белков в денатурирующих условиях.
2.9 Электрофорез белков в нативных условиях (основный) для белков, у которых pI (изоэлектрическая точка) <7.
2.10 Электрофорез белков в нативных условиях (кислотный) для белков, у которых pI (изоэлектрическая точка) >7.
2.11 Окрашивание белковых гелей кумасси синим.
2.12 Окрашивание белковых гелей нитратом серебра.
ВОЗМОЖНЫЕ ПРОБЛЕМЫ И СПОСОБЫ ИХ РЕШЕНИЯ.
ИСПОЛЬЗОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА.



Бесплатно скачать электронную книгу в удобном формате, смотреть и читать:
Скачать книгу Практикум по гетерологичной экспрессии белков, Журавлева Д.Э., Исхакова З.И., Тризна Е.Ю., 2022 - fileskachat.com, быстрое и бесплатное скачивание.

Скачать pdf
Ниже можно купить эту книгу по лучшей цене со скидкой с доставкой по всей России.Купить эту книгу



Скачать - pdf - Яндекс.Диск.
Дата публикации:





Хештеги: :: :: :: :: ::


Следующие учебники и книги:
Предыдущие статьи: